BUNSEN本生帶您了解：怎樣分析ELISA試劑盒包被和封閉問題

　　BUNSEN本生帶您了解：怎樣分析ELISA試劑盒包被和封閉問題

　　一、 Elisa試劑盒包被方式

　　將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。

　　大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法。

　　親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，ELISA試劑盒這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱或冷風吹干，待酒精揮發后，讓脂質自然干固在固相表面。

　　優點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。

　　二、包被用抗原

　　天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。

　　三、包被用抗體

　　IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯結發生在Fc段上，ELISA試劑盒抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。

　　腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

　　四 、包被的條件

　　pH9.6碳酸鹽緩沖液

　　pH7.2的磷酸鹽緩沖液

　　pH7-8的Tris-HCL緩沖液

　　加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置，37℃中保溫2小時。ELISA試劑盒包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。

　　二、Elisa試劑盒封閉問題

　　封閉是ELISA實驗中的一個步驟，而封閉的重要性是在于實驗模式的，今天上海恒遠和您一起重點來看這個問題。

　　抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。

　　封閉劑：

　　1. zui常用的是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。

　　2. 也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。

　　3. 脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用(5%)。

　　4. 高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。

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